分子技术在青贮饲料微生物生态学中的应用

（青贮研究进展-2） 

农业农村部青贮饲草料加工技术集成科研基地（中国农业大学）

国家燕麦荞麦产业技术体系饲草及副产物综合利用岗位（中国农业大学）

   编译

编者按：《Journal of Dairy Science》 杂志近期出版了一期青贮研究进展专辑，总共12篇文章。为传播青贮最新进展，我们对文献进行了摘要翻译，供从事青贮产学研的同行参考。

摘要：青贮是一种微生物驱动的过程。利用微生物技术可鉴定青贮过程中关键的乳酸生产菌及导致青贮变质的梭菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌。随着比较基因组学，宏基因组学和宏转录组等测序技术的进一步发展，传统PCR分子技术无法鉴定的新物种被逐渐挖掘。同时，这些技术揭示了微生物群落结构对饲草类型、青贮方法及有氧暴露响应的特征性转变。分子生物学的进步为青贮微生物生态学的研究带来了巨大变革。

关键词：青贮饲料、微生物生态、生物技术、微生物组

引言：过去几十年中多使用培养法及非培养法（LH-PCR、DGGE、ARISA、T-RFLP）研究青贮微生物群落的结构和多样性。如今，多种平台宏基因组深度测序（Ilumina, Roche 454, Ion Torrent, PacBio）及特异性定量微生物物种的q-PCR技术越来越多地应用于青贮微生物领域。信息学的分析结果取决于提取的核酸质量、引物特性、PCR抑制剂及测序平台的选择。本文综述了目前用于青贮微生物研究的分子技术，并对其在未来青贮领域的应用进行了展望。

1 核酸样品的提取及保存

1.1 核酸样品的提取

青贮饲料中核酸样品的提取多使用商业试剂盒。不同的提取试剂盒对提取的青贮微生物群落有不同的影响。研究发现，FastDNA Spin试剂盒由于裂解细胞能力更强，其产量是MoBio试剂盒的两倍。乳酸菌作为革兰氏阳性菌具有更厚的肽聚糖细胞壁，利用珠击法破壁的试剂盒提取效率更高。

1.2 核酸样品的提取预处理及保存

青贮生物样本在-80-20℃范围内短期贮存（14 d）对菌落多样性影响较小。核酸样品经提取后应立即进行超低温冷冻。固体青贮样品冻干，通过研磨或球磨后进行DNA的提取，固体样品的提取方式容易增加共同分离出的植物DNA量，潜在降低了分析的准确度。液体提取方法即将青贮样品在生理盐水中多次洗涤（5-10次），将提取物离心并收集细胞后进行DNA提取。液体提取法更有利于降低植物组织DNA的污染，但缺点是植物内生微生物DNA难以被提取。由于RNA的不稳定性，青贮样品在进行RNA提取时应立即在液氮中冷冻并在液氮中研磨成细粉以增加RNA提取量。核酸样品可溶解在乙醇中，在超低温条件下贮藏。

2 青贮饲料分子分析中PCR的使用

通过PCR扩增基因得到的产物进行测序来鉴定青贮微生物是一种非培养分析法。qPCR可用于量化特定物种或整体细菌种群。引物特异性和待扩增片段长度等因素会影响PCR的扩增效率。而测序技术的使用可减少由于扩增和引物错配引起的偏差，同时生成微生物功能和分类信息。

对于原核微生物，细菌核糖体RNA操纵子通过转录过程，形成一个含有小亚基（SSU或16S）的前核糖体RNA、大亚基（LSU或23S）和5S rRNA序列的转录产物。16S和23S基因广泛用于原核生物的菌种鉴定。16S rRNA基因包括9个高变区（V1-V9），高变区在不同细菌菌种之间表现出较大的特异性，因此可以用于菌种鉴定。若16S rRNA基因由于高度同源性而不能区别相近物种时，其他不同的位点如CPN-60和recA可用于表征细菌多样性。真核生物rRNA操纵子由SSU（18S）和LSU（25S / 28S）组成，由包含ITS1和ITS2的ITS区隔开，分别位于5.8S保守区两侧。青贮微生物中酵母菌和霉菌鉴定通常使用18S rRNA，26S rRNA或ITS区进行扩增。

3 分子技术在青贮饲料微生物生态学的研究应用

3.1 菌种的鉴定和定量分析

qPCR可用于鉴定并量化青贮过程中的细菌和真菌，用于qPCR的物种特异性引物recA基因可以鉴定青贮饲料中的乳杆菌属的菌种、屎肠球菌，戊糖片球菌和枯草芽孢杆菌。而qPCR方法虽然在青贮中使用普遍，也存在特异微生物被高估的弊端。

3.2 群落分析

传统的微生物群落分析—分子指纹技术（包括DGGE、T-RFLP、ARISA和LH-PCR）提供了微生物群落基因多样性分析的模板。而NGS测序由于具有高的分辨率和较低的成本更新了传统微生物群落分析的分子技术。

3.3 宏基因组学

基于NGS的宏基因组学研究有两种：（1）单/标记基因扩增基因组学，或称之为扩增子（例如16S原核生物中的rRNA基因）测序分析；（2）鸟枪法宏基因组学。这些方法对微生物非培养状态下的群落多样性进行分析描述。相比鸟枪法宏基因组学，扩增子测序在复杂生态系统下生成的微生物群落系统分类投入的时间和计算较少，成本较低，污染少。然而，扩增子测序因为使用引物扩增，分辨率较低，难以识别细菌种的水平。此外，扩增子测序目前没有标记基因用于病毒的扩增检测。在扩增子测序中，扩增不同的可变区（V）使细菌群落动态定量评估中的分类特点、操作分类单元（OTU）丰富度和OTU多样性产生不同的结果。相比较扩增子测序，全长16S rRNA基因（~1,500 bp）测序对细菌的分类鉴定更精确。

尽管通过扩增子测序来描述微生物群落及PICRUSt进行功能预测分析的使用较广泛，但16S功能预测分析不能产生完整的微生物群落遗传图谱。相反，鸟枪法宏基因组测序提供了微生物群落的全面遗传信息及非培养微生物功能和系统发育之间的基因组联系。由于群落中所有真核微生物以及病毒都能被检测到，还避免了不同可变区扩增导致的结果偏倚。它的缺点是成本高、易产生宿主污染以及测序深度的局限性使稀有物种信息不全。由于青贮饲料的发酵在很大程度上是细菌驱动的过程，且细菌种群的数据库比真菌的数据库更大，大多数宏基因组学研究主要集中在青贮细菌生态学研究。

青贮微生物NGS测序的研究主要针对青贮接种剂的效果、青贮过程中细菌种群间的差异、青贮饲料中不同饲料类型或微生物群落的时间和空间异质性等对微生物群落进行分析。NGS的研究发现，细菌多样性随青贮进程的持续而降低，自然附生细菌种群受青贮牧草类型的影响。乳杆菌属在青贮过程中占优势，乳酸菌在青贮微生物中起主导作用的程度与良好的青贮条件有关。因此，青贮环境的微小变化就能引起饲料表面微生物群落的很大改变。青贮后期，添加剂的使用会降低青贮微生物的多样性。大部分研究表明作为单一添加剂的菌株会在青贮末期成为优势菌群，然而材料和添加的菌种不同对微生物多样性的影响也不相同。测序技术也用于青贮饲料的真核微生物研究，主要针对真核微生物对饲料的有氧变败、霉菌毒素的产生、饲喂风险评估及饲料安全的影响方面。相比细菌群落，青贮的酸性和厌氧环境不利于真菌的生长，很多真菌在青贮期间会进入休眠状态，有氧暴露后会恢复活力。

3.4 功能测序

相比扩增子测序，鸟枪法宏基因组测序可以更全面地描述微生物系统发育及功能代谢相关的基因特征，可用于表征青贮涉及到的生物化学途径，例如霉菌毒素的产生和降解等。未来青贮饲料中使用RNA样品的功能测序研究可以从以下几个方面展开：研究与霉菌毒素形成和降解相关的基因表达，得到降低青贮饲料中霉菌毒素水平的方法；研究编码抗菌剂如细菌素的基因表达，用于减少青贮中腐败菌的生成；研究编码碳水化合物降解的基因，探究如何使用参与植物细胞壁降解的酶来提高青贮饲料消化率；鉴定接种菌之间的差异表达，揭示特定菌株在青贮饲料中更强适应性、或在饲喂动物时发挥益生特性的原因。

4 结论

NGS测序技术正在为青贮相关的微生物生态学的研究带来革命性变化。样品的采集、储存、核酸提取、测序和分析都会影响青贮微生物种群的组成和功能解释。因此，应当谨慎使用不同的分子技术进行研究。此外，用于分析的数据库的完整性有待提高。宏基因组学的研究有利于提高青贮品质和安全性，并进一步提高使用添加剂的功效，从而改善青贮进程。

文献来源：

McAllister T A,Dunière L, Drouin P, et al. Silage review: Using molecular approaches to definethe microbial ecology of silage[J]. Journal of dairy science, 2018, 101(5):4060-4074.

（注：国家牧草产业技术创新战略联盟、北京华夏草业产业技术创新战略联盟、北京助尔生物科学研究院编辑）